rozwiązywanie problemów z western blot

Rozwiąż problemy z western blot, korzystając z tych wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów, obejmujących typowe przyczyny braku sygnału, wysokiego tła, wielu pasm i nie tylko.

1. Brak sygnału
2. Wysokie tło.
3. Wiele zespołów.
4. Nierówne białe „plamki” na plamie.
5. Czarne kropki na kleksie.
6. Białe paski na czarnym kleksie.
7. Pas oznaczający masę cząsteczkową jest czarny.

1. Dlaczego mój western blot nie działa?
2. Dlaczego moja western blot jest rozmazana?
3. Czy myjesz po zablokowaniu Western blot?
4. Co powoduje niespecyficzne wiązanie w Western blot?
5. Jak mogę poprawić wyniki Western blot?
6. Dlaczego używamy mleka w Western blot?
7. Jakie są kroki western blotting?
8. Czy możesz przesyłać Western Blot?
9. Jak potwierdzić transfer prążków białkowych z żelu do błony w protokole Western Blot?
10. Jak długo możesz blokować western blot?
11. Czy możesz zablokować western blot w weekend??
12. Ile razy można zdjąć western blot?

Dlaczego mój western blot nie działa?

Jeśli masz za mało białka, jeśli twoje pierwotne przeciwciało nie ma wysokiego powinowactwa lub jeśli twoje pierwotne przeciwciało ma suboptymalne rozcieńczenie, nie zobaczysz swojego białka. Alternatywnie, jeśli załadujesz zbyt dużo białka, stosunek sygnału do szumu może wzrosnąć, powodując trudności w wizualizacji.

Dlaczego moja western blot jest rozmazana?

Jaki jest powód rozmazu w western blot? Jak widać po zabarwieniu ponceau na transferze, przez pierwsze 7 pasów przechodzi smuga. Próbki to embrionalne komórki macierzyste poddane lizie w buforze do próbek 2xLSB, pipetowaniu i gotowaniu. ... Najwyraźniej rozmaz jest spowodowany zbyt dużą liczbą komórek w studzience.

Czy myjesz po zablokowaniu Western blot?

Blokowanie jest bardzo ważnym krokiem w fazie immunodetekcji w analizie Western blot, ponieważ zapobiega niespecyficznemu wiązaniu przeciwciała z membraną do blottingu. Po zablokowaniu bibułę przepłukuje się buforem do przemywania, zwykle TBST, z delikatnym mieszaniem i w wystarczającej objętości, aby utrzymać bibułę w zanurzeniu. ...

Co powoduje niespecyficzne wiązanie w Western blot?

Jedną z najczęstszych przyczyn niespecyficznych pasm jest niepełne blokowanie. Bufory blokujące służą do zapobiegania wiązaniu się przeciwciał pierwotnych i wtórnych z błoną lub czegokolwiek innego niż białko będące przedmiotem zainteresowania.

Jak mogę poprawić wyniki Western blot?

Rozwiązanie

1. Zmniejsz stężenie przeciwciał pierwszorzędowych.
2. Zmniejsz ilość całkowitego białka załadowanego na żel.
3. Dostosuj warunki blokowania membrany.
4. Zwiększyć liczbę prań.
5. Sprawdź specyficzność przeciwciała.
6. Blot z samym przeciwciałem drugorzędowym.
7. Jeśli pojawią się prążki, wybierz alternatywne przeciwciało drugorzędowe.

Dlaczego używamy mleka w Western blot?

Blokowanie jest bardzo ważnym etapem western blot, ponieważ zapobiega niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał z błoną. Blokowanie jest często wykonywane za pomocą 5% BSA lub odtłuszczonego mleka w proszku rozcieńczonego w TBST w celu zmniejszenia tła. ... Przeciwciało można rozcieńczyć w buforze do przemywania, takim jak PBS lub TBST.

Jakie są kroki western blotting?

Pięć etapów obejmuje procedurę western blot i test wykrywania, a mianowicie transfer, blokowanie, inkubację przeciwciał pierwszorzędowych, inkubację przeciwciał wtórnych i wykrywanie białek oraz analizę western blot.

Czy możesz przesyłać Western Blot?

Jednak wraz z upływem czasu istnieje ryzyko nadmiernego przenoszenia (odpędzania, przedmuchiwania) białek przez błonę, szczególnie w przypadku niższej masy cząsteczkowej (<30 kDa) przy zastosowaniu membran o większej wielkości porów (0,45 µm). Przebieg pracy elektrotransferu mokrego / zbiornikowego białka do western blotting.

Jak potwierdzić transfer prążków białkowych z żelu do błony w protokole Western Blot?

Protokół transferu białek

1. Przygotuj membranę PVDF, zwilżając ją w metanolu przez 30 sekund, a następnie zanurzając ją krótko w wodzie destylowanej, a następnie 1X bufor transferowy. ...
2. Zanurzyć bibuły filtracyjne i gąbki w buforze transferowym na 10 minut przed złożeniem kanapki transferowej.

Jak długo możesz blokować western blot?

Generalnie maksymalny czas blokowania nie powinien przekraczać 2 godzin w temperaturze pokojowej, inaczej można wymieniać białka z membrany. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe do zalecanego stężenia / rozcieńczenie w świeżym roztworze blokującym (TBS i / lub PBS (tabletki PBS 524650-1EA) / 3% odtłuszczone mleko w proszku).

Czy możesz zablokować western blot w weekend??

Silne miana przeciwciał działają najlepiej przy krótkiej inkubacji, a słabe przeciwciała w oponach wymagają dłuższej inkubacji (przy wyższym stężeniu). Pozostawienie blota w buforze blokującym na noc lub przez weekend w 4 ° C nie boli.

Ile razy można zdjąć western blot?

również, gdy próbujemy usunąć pierwotne przeciwciała, warto zauważyć, że istnieje prawdopodobieństwo, że możesz stracić część białka, które przyczepiłeś lub przeniesiono na błonę, dlatego nie zaleca się zdejmowania membrany więcej niż jeden raz.